Мечение нуклеиновых кислот

Щелочная фосфатаза катализирует отщепление 5’- и 3’-фосфатных групп от ДНК, РНК и нуклеотидов, а также от белков.

Термочувствительная фосфатаза FastAp активна во всех рестриктазных и ПЦР-буферах. Она дефосфорилирует все типы концов ДНК (липкие и тупые) в течение 10 минут при +37оС и инактивируется при +75оС в течение 5 минут, поэтому не требуется очистка реакционной смеси перед лигированием.

Особенности щелочной фосфатазы FastAp:

Рекомбинантный белок;быстрое дефосфорилирование - 10 минут;быстрая инактивация - 5 минут;можно использовать для одновременного расщепления и дефосфорилирования векторной ДНК;активна во всех рестриктазных и ПЦР-буферах;дефосфорилирует белки;используется для очистки ПЦР-смесей совместно с ExoI.

Области применения:

Дефосфорилирование векторной ДНК при клонировании;очистка ПЦР-продуктов из реакционных смесей перед секвенированием;дефосфорилировнание 5’-концов ДНК перед мечением полинуклеотидкиназой Т4;другие экперименты, связанные с дефосфорилированием нуклеиновых кислот;дефосфорилирование белков.

Важно!

Связывание фосфатазы с ДНК може приводить к смещению полос в агарозном геле. Во избежание подобного смещения рекомендуется добавлять к электрофорезным образцам буфер для нанесения с SDS и инкубировать образцы в течение 10 минут при +65оС, а затем охладить во льду.

Условия хранения: -20оС

Полинуклеотидкиназа Т4 катализирует перенос гамма-фосфата от АТФ на 5’-концевую ОН-группу ДНК, РНК, олигонуклеотидов или нуклеозид-3’-монофосфатов (прямая реакция).Эта реакция обратимая. В присутствии АДФ полинуклеотидкиназа проявляет 5’-фосфатазную активность и катализирует обмен фосфатными группами между 5’-фосфорилированными полинуклеотидными цепями и АТФ (реакция обмена). Также фермент обладает 3’-фосфатазной активностью.

Полинуклеотидкиназа Т4 от Thermo Scientific активна в рестриктазных буферах, лигазном буфере и буфере для обратной транскрипции.

Области применения:

Мечение 5’-концов нуклеиновых кислот с целью получения гибридизационных зондов, зондов для транскриптов, маркеров для электрофореза, праймеров для секвенирования и ПЦР;

5’-фосфорилирование синтетических олигонуклеотидов, ПЦР-продуктов, ДНК и РНК перед лигированием;

выявление модификаций ДНК с помощью [32P];

отщепление 3’-концевых фосфатов.

Полинуклеотидкиназа Т4 Thermo Scientific комплектуется 10-кратными буферами А (для прямой реакции), В (для реакции обмена) и 24% раствором ПЭГ 6000.

Полиэтиленгликоль повышает эффективность реакции фосфорилирования и используется в реакции обмена.

Важно! Полинуклеотидкиназа ингибируется ионами аммония, поэтому при осаждении фосфорилируемой ДНК рекомендуется использовать ацетат натрия.

Условия хранения: -20оС

Полинуклеотидканаза катализирует перенос фосфата от АТФ на 5’ конец ДНК или РНК, используется для концевого мечения НК, фосфорилирования праймеров, удаления 3’- фосфорильных групп. Рекомбинантная форма, выделенная из E. coli.

Буфер хранения: 10 мМ трис-HCl рН 7,4, 50 мМ KCl, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 50% глицерин.

Условия определения активности: 70 мМ трис-HCl рН 7,6, 10 мМ MgCl2, 5 мМ ДТТ, 66 мкМ [g32Р] АТФ, 20 мкМ 18-20-мерный гетеродезоксиолигонуклеотид.

Определение единицы активности:

Одна единица активности соответствует количеству фермента, катализирующему включение 1 нмоль [32Р] в кислотонерастворимую фракцию за 30 мин при 37 °С.

Хранение и транспортировка при -20 °С.